Skip to content

Polimorficzne markery mikrosatelitarne do diagnozy choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi cd

2 miesiące ago

496 words

Powielony DNA początkowo poddano elektroforezie w 5% żelu akryloamidowym. Aby wykryć różne polimorficzne allele, zamplifikowane fragmenty DNA naniesiono na 10-procentowy żel akryloamidowy o niedostatecznej wartości, który miał 40 cm długości i 0,5 mm grubości w buforze TBE (44,5 mM TRIS-boran i mM EDTA). Próbki poddano elektroforezie przez 12 godzin przy 400 V, a żel wybarwiono srebrem (Daiichi Kagaku). Wyniki
Rysunek 1. Rysunek 1. Walidacja analizy polimorfizmu DNA. Aby przetestować czułość metody, próbki DNA z komórek krwi obwodowej dwóch zdrowych osobników zmieszano w różnych proporcjach, a następnie zbadano za pomocą analizy polimorfizmu DNA po PCR z użyciem starterów TCFIID (panel A). Ścieżka pokazuje produkty PCR z DNA podmiotu (stałe trójkąty); ścieżka 11, produkty z DNA podmiotu 2 (otwarte trójkąty); i ścieżki 2 do 10, te z mieszanin DNA od obu osobników we wskazanych stosunkach. Obecność niepodlegającego DNA można wykryć w mieszaninach 9: i 1: 9 (ścieżki 2 i 10).
W ocenie różnicowej krążących limfocytów dawców, DNA ekstrahowano z próbek krwi pacjenta bez GVHD po transfuzji przed i po transfuzji przechowywanej krwi pełnej (200 ml), amplifikowano za pomocą zestawu starterów INT i analizowano razem z próbką od dawcy pacjenta (Panel B). DNA dawcy nie wykryto w próbkach pobranych od pacjenta po transfuzji. Ścieżka przedstawia marker wielkości DNA phiX174 trawiony Haellll; ścieżka 2, produkty PCR z komórek krwi obwodowej dawcy (z pasmami dawcy oznaczonymi przez stałe groty strzałek); ścieżka 3, produkty PCR z komórek przedprocesorowych krwi obwodowej pacjenta (z pasmami pacjenta oznaczonymi przez otwartą grot strzałki); i ścieżki 4 do 9, produkty PCR z komórek krwi obwodowej pacjenta w dniach 1, 2, 3, 4, 5 i 6 po transfuzji.
Aby ocenić czułość metody, wymieszaliśmy próbki DNA z leukocytów dwóch osobników w stosunkach od 10: 0 do 0:10. Mogliśmy wykryć obecność niepodlegającego DNA w 10-krotnym rozcieńczeniu całkowitego DNA osobników (Figura 1A). Następnie próbowaliśmy wykryć krążące limfocyty dawcy, analizując polimorfizmy DNA u czterech pacjentów bez GVHD po transfuzji. Pierwsi z tych pacjentów otrzymali 200 ml przechowywanej krwi pełnej podczas operacji; pozostali trzej, którzy mieli ostrą białaczkę szpikową, otrzymali 20 jednostek przefiltrowanego koncentratu płytek krwi od jednego dawcy, 10 jednostek koncentratu płytek krwi od jednego dawcy i 10 jednostek koncentratu płytek krwi od 10 losowych dawców, odpowiednio. Krew do analizy DNA uzyskano od pacjentów przed transfuzją i przez pierwsze sześć dni po transfuzji i od odpowiednich dawców. W żadnej próbce po transfuzji nie znaleziono pasm pochodzenia dawcy (Figura 1B).
Figura 2. Figura 2. Wyniki analizy polimorfizmu DNA u pacjenta po GVHD po transfuzji. Do amplifikacji PCR użyto pięć zestawów starterów mikrosatelitarnych (INT, TCFIID, D6S89, D11S534 i HGH). Ścieżka pokazuje marker wielkości DNA pBR322 trawiony MspI; ścieżka 2, produkty PCR z przedprocesorowej krwi obwodowej pacjenta (z pasmami pacjenta oznaczonymi litymi trójkątami); ścieżka 3, produkty PCR z komórek krwi obwodowej pacjenta po transfuzji; i ścieżkę 4, produkty PCR z komórek krwi obwodowej dawcy (z pasmami dawcy oznaczonymi przez otwarte trójkąty)
[patrz też: allergicus szczecin, alergo vita bydgoszcz, junical ]

0 thoughts on “Polimorficzne markery mikrosatelitarne do diagnozy choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi cd”